Redigerad av Peter Sarnow, Stanford University School of Medicine, Stanford University, Kalifornien, godkänd den 25 december 2020 (reviderad den 25 oktober 2020)
Vi rapporterar interaktionen mellan subenheter i replikeringen av koronavirus-transkriptionskomplex, som är väsentliga för replikering och evolutionär bevarande.Vi gav bevis för att NiRAN-domänen associerad med nsp12 har nukleosidmonofosfat (NMP) transferasaktivitet i trans, och identifierade nsp9 (ett RNA-bindande protein) som sitt mål.NiRAN katalyserar den kovalenta bindningen av NMP-delen till den konserverade nsp9-aminoterminalen i en reaktion som förlitar sig på Mn2+-joner och intilliggande konserverade Asn-rester.Det visade sig att NiRAN-aktivitet och nsp9 NMPylering är väsentliga för replikering av koronavirus.Data gör det möjligt för oss att koppla denna aktivitet hos den kapslade virusenzymmarkören till de tidigare observationerna i hypotesen att initieringen av RNA-syntes i en klass av RNA-virus är funktionellt och evolutionärt konsekvent.
Det RNA-beroende RNA-polymeraset (RdRps) från Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae och 12 andra familjer) är kopplat till den aminoterminala (N-terminala) domänen i det icke-strukturella proteinet (nsp) som frisätts från polyproteinet, kallat NiRAN 1ab är sammansatt av viralt huvudproteas (Mpro).Tidigare rapporterades det arteriella viruset NiRAN-RdRp nsp:s egen GMPylerings/UMPyleringsaktivitet, och det föreslogs generera en transient för överföring av nukleosidmonofosfat (NMP) till (för närvarande okända) virus och/eller cellbiopolymerisation.Här visar vi att coronaviruset (Human Coronavirus [HCoV]-229E och Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) har Mn2+-beroende NMPyleringsaktivitet, som härrör från nsp9 genom bildandet av Mpro-medierad nsp9 efter den N-terminala flankerande nsps frisätts proteolytiskt, fosforamidatet är bundet till den primära aminen (N3825) vid N-terminalen av nsp9.Uridintrifosfat är den föredragna nukleotiden i denna reaktion, men adenosintrifosfat, guanosintrifosfat och cytidintrifosfat är också lämpliga samsubstrat.Mutationsstudier med användning av rekombinanta coronavirus nsp9- och nsp12-proteiner och genetiskt modifierade HCoV-229E-mutanter bestämde de rester som var nödvändiga för NiRAN-medierad nsp9 NMPylering och virusreplikation i cellkultur.Data bekräftade förutsägelsen av NiRAN-rester på det aktiva stället och bestämde den viktiga rollen för nsp9 N3826-rester i nsp9 NMPylering och virusreplikation in vitro.Denna rest är en del av den konserverade N-terminala NNE-tripeptidsekvensen och visade sig vara den enda invarianta resten av nsp9 och dess homologer i familjen coronavirus.Denna studie ger en solid grund för den funktionella studien av NMPyleringsaktivitet hos andra kapslade virus och föreslår möjliga mål för utvecklingen av antivirala läkemedel.
Nidovirales positivt-strängat RNA-virus infekterar en mängd olika ryggradsdjur och ryggradslösa djur (1, 2).Ordern omfattar för närvarande 14 familjer (3), varav Coronavirusfamiljen har studerats mycket under de senaste 20 åren.Vid den tiden dök tre zoonotiska coronavirus upp från djurvärdar och orsakade storskaliga utbrott av allvarliga luftvägsinfektioner hos människor.Inklusive ihållande pandemier orsakade av svåra akuta infektionssjukdomar.Respiratoriskt syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4ââââ7).Nidovirus delar en gemensam genomorganisation och subenheten av det membranbundna replikations-transkriptionskomplexet (RTC) kodas i de 5-?²-terminala två tredjedelarna och den huvudsakliga strukturella subenheten av viruspartikeln, såväl som vissa tillbehör .Protein, kodat i 3??² ändtredjedelen av genomet (1).Förutom en familj av planära virus (Monoviridae) (8), kodar alla kapslade virus RTC-subenheter i två stora öppna läsramar (ORF) ORF1a och ORF1b, som översätts från genomiskt RNA av.ORF1a kodar för polyprotein (pp) la, och ORF1a och ORF1b kodar gemensamt för pp1ab.Med det allmänna deltagandet av huvudproteaset (Mpro) som kodas av ORF1a, processas både pp1a och pp1ab proteolytiskt till en mängd olika icke-strukturella proteiner (nsps), även kända som 3CLpro, eftersom det har homologi med 3Cpro av picornaviruset ( 9).Dessa nsps tros vara sammansatta till en stor dynamisk RTC, katalyserar syntesen av genomiskt RNA (replikation) och en uppsättning av subgenomiskt RNA (transkription), och används för att koordinera uttrycket av ORF som ligger nedströms ORF1b (10? ? ?12).
RTC-kärnan inkluderar RNA-beroende RNA-polymeras (RdRp) (13), superfamilj 1-helikas (HEL1) (14, 15) och flera RNA-bearbetningsenzymer, som huvudsakligen är kodade i ORF1b och i coronavirusfamiljen. Den innehåller nsp12-nsp16 och nsp9-nsp12 i familjen Arterioviridae (se referens 10ââ 12).RdRp och HEL1 representerar två (en femtedel) konserverade domäner av fågelboet virus och har homologi bland andra RNA-virus.Kärnreplikas tros assisteras av andra subenheter, inklusive flera små nsps frisatta från den karboxiterminala (C-terminala) regionen av pp1a, nedströms om Mpro (coronavirus nsp5 respektive arteriellt virus nsp4).De har ett begränsat familjespecifikt skydd och olika aktiviteter (recenserat i referens 10ââ12).
Relativt nyligen hittades en domän med unika sekvensmotivegenskaper vid aminoterminalen (N-terminalen) intill RdRp i alla kapslade virus, men inga andra RNA-virus (16).Baserat på dess lokalisering och aktivitet av nukleotidtransferas (nukleosidmonofosfat [NMP]-transferas) benämns denna domän NiRAN (Nestvirus RdRp-relaterat nukleotidtransferas).Dubbeldomänkombinationen av NiRAN-RdRp utgör nsp12 i Coronaviridae-familjen och nsp9 i Arterioviridae-familjen, och i andra nestoviridae förväntas NiRAN-RdRp frigöras som en oberoende nsp från det virala polyproteinet.I coronaviruset innehåller NiRAN-domänen ??1/450 rester och är ansluten till den C-terminala RdRp-domänen genom länkområdet (16?19).I Equine Arteritis Virus (EAV) (Arteriviridae) visar rekombinant nsp9 Mn2+ jonberoende (själv) UMPylerings- och GMPyleringsaktiviteter, vilka beror på tre konserverade sekvensbaser i nestovirus, AN, BN och CN. Resterna i sekvensen.Där N står för NiRAN) (16).Den N-terminala flankeringen av dessa motiv är ett mindre konservativt motiv preAN.Vissa av dessa rester är också konserverade i avlägset besläktade proteinkinaser, där de har visat sig vara involverade i bindning av nukleosidtrifosfat (NTP) och katalytisk aktivitet (20, 21).I enlighet med denna observation kan flera viktiga aktiva platser i pseudokinas SelO från Pseudomonas syringae sättas ihop med det nyligen publicerade SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 superkomplexet.Bevarade Coronavirus NiRAN-rester överlagrade i elektronmikrostrukturen.Rekombinant protein (17).Det spekuleras att den dokumenterade (själv) U/GMPyleringen kommer att producera ett övergående tillstånd för att överföra NMP till det (för närvarande okända) substratet (16), och den strukturella likheten mellan NiRAN och proteinkinas (17, 19) ) Är hypotesen att NiRAN modifierar andra proteiner.
Många funktioner, inklusive dess unika och unika systematiska association med kapslade virus och genetisk separation från RdRp, gör NiRAN till ett rimligt nyckelregulatoriskt enzym för kapslade virus, vilket är avgörande för deras uppkomst och identitet.Tidigare kallades tre möjliga funktioner som involverar NiRAN för att reglera genom/subgenomisk translation eller replikation/transkription.När man tar hänsyn till de knappa och ofullständiga uppgifter som finns tillgängliga vid den tidpunkten, har varje funktion sina fördelar och nackdelar (16).I denna forskning strävar vi efter att kombinera de biokemiska och omvända genetiska studierna av koronavirus som representerar de två släktena, och sätta våra fynd i den evolutionära bakgrunden av den naturliga mutationen av coronavirusfamiljen, för att få insikt i detta mystiska rike.Vi rapporterar stora framsteg i förståelsen av NiRAN genom identifiering av naturliga mål i RTC, vilket (bland de tre tillgängliga hypoteserna) bidrar till denna domäns roll i att initiera syntesen av kapslad virus-RNA.Denna forskning öppnar också möjligheter för andra roller av NiRAN på virusvärdgränssnittet.
För att karakterisera de enzymatiska egenskaperna hos den koronavirus nsp12-relaterade NiRAN-domänen producerade vi en rekombinant form av humant coronavirus 229E (HCoV-229E) nsp12 i E. coli, med en His6-tagg vid C-terminalen, och kombinerade protein med [α32-P ] Inkubera tillsammans med NTP i närvaro av MnCl2 enligt beskrivning i Material och metoder.Analysen av reaktionsprodukten indikerade närvaron av ett radiomärkt protein som sammigrerade med nsp12 (106 kDa), vilket indikerar att coronavirus nsp12 katalyserar bildningen av kovalenta protein-NMP-addukter, företrädesvis bildade med uridinmonofosfat (UMP) (Figur 1A) och B).Kvantitativ analys visade att jämfört med andra nukleotider ökade signalintensiteten för UMP-inkorporering med 2 till 3 gånger (Figur 1C).Dessa data överensstämmer med den förutsagda NMP-transferasaktiviteten för NiRAN-domänen av coronaviruset (16), men indikerar att nukleotidpreferenserna för NiRAN-domänen av coronaviruset och det arteriella viruset är olika.
Själv-NMPyleringsaktivitet av HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) inkuberades med den betecknade [a-32P] NTP i närvaro av 6 mM MnCl2 under 30 minuter (se Material och metoder för detaljer).Reaktionsprodukterna separerades med SDS-PAGE och färgades med Coomassie brilliant blue.(B) Det radiomärkta proteinet visualiseras genom fosforavbildning.Positionerna för nsp12-His6 och proteinmolekylmassamarkörer (i kilodalton) visas i A och B. (C) Intensiteten hos den radioaktiva signalen (medelvärde ± SEM) bestämdes från tre oberoende experiment.*P≤0,05.Signalstyrkan (procent) är relaterad till UTP.
Även om NiRAN-relaterade enzymaktiviteter har visat sig vara väsentliga för replikering av EAV och SARS-CoV i cellkultur (16), har den specifika NiRAN-funktionen och potentiella mål ännu inte fastställts.Den nyligen rapporterade strukturella likheten mellan NiRAN och en familj av proteiner med proteinkinasliknande veck (17, 22) fick oss att testa hypotesen att NiRAN katalyserar NMPyleringen av andra proteiner.Vi genererade en uppsättning potentiella homologa mål, inklusive icke-strukturella proteiner kodade av HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), var och en innehållande en C-terminal His6-tagg (SI-tillägg, Tabell S1), och inkubera dessa proteiner med [α32-P] uridintrifosfat ([α32-P]UTP) i närvaro eller frånvaro av nsp12.Bovint serumalbumin och MBP-LacZa-fusionsprotein producerat i E. coli tjänade som kontroller (Figur 2A, spår 1 till 7).Det radiomärkta proteinet analyserades genom natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) och autoradiografi, och det visade sig att det fanns en stark radioaktiv signal i reaktionen innehållande nsp12 och nsp9.Signalens position motsvarar molekylmassan för nsp9, vilket indikerar nsp12-medierad UMPylering av nsp9 (Figur 2B, spår 7).Inga andra testproteiner visade sig vara UMPylerade, vilket fick oss att dra slutsatsen att nsp9 är ett specifikt substrat för nsp12.I enlighet med de själv-NMPyleringsdata som visas i figur 1 kan nsp12 överföra alla fyra NMP till nsp9, även om effektiviteten är annorlunda, UMP> adenosinmonofosfat (AMP)> guanosinmonofosfat (GMP)> cytidinmonofosfat (CMP) ) ( Bild).3A och B).Under de förhållanden som används i denna analys (förkorta reaktions- och exponeringstiden, minska koncentrationen av nsp12; material och metoder), kunde själv-NMPyleringen av nsp12 inte detekteras (jämför figur 2B, bana 7 och figur 1B), vilket visade sig vara en effektiv (Och flera omgångar) UMP flyttade från nsp12 till nsp9.UMP-transferasaktivitet kräver närvaro av Mn2+-joner, som visas i figur 3C, medan endast minimal UMP-transferasaktivitet observerades i närvaro av Mg2+, och ingen aktivitet i närvaro av de andra två testade tvåvärda katjonerna.Liknande data erhölls i NMPyleringsanalyser innehållande cytidintrifosfat (CTP), guanosintrifosfat (GTP) och adenosintrifosfat (ATP) (SI bilaga, figur S1).
HCoV-229E nsp12-medierad UMPylering av nsp9.En serie proteinsubstrat (inklusive bovint serumalbumin, MBP-lacZα och en serie HCoV-229E nsps märkta med C-terminal His6 kodad av ORF1a) användes för att utvärdera UMPyleringsaktiviteten av HCoV-229E nsp12-His6+-medierad protein.Inkubera proteinet med [α-32P] UTP i 10 minuter i frånvaro (A) eller närvaro (B) av nsp12 enligt beskrivningen i materialen och metoderna.Överst på A och B visas SDS-polyakrylamidgel färgad med Coomassie Brilliant Blue, och längst ner på A och B visas motsvarande autoradiogram.Positionen för proteinmolekylmassamarkören (i kilodalton) anges till vänster.Positionen för nsp12-His6 (B, överst) och den radioaktiva signal som observerades under inkubationen av nsp12-His6 med nsp9-His6 (B, bana 7) indikeras också, vilket indikerar att [α-32P]UMP till nsp9-His6 (12,9 kDa), vilket inte observerades för andra testade proteiner.
HCoV-229E NiRAN-medierad biokemisk och virologisk karakterisering av nsp9 NMPylering.(A och B) Rollen för nukleotidsamsubstratet som används i reaktionen.Nsp12-His6 och nsp9-His6 blandas och inkuberas i närvaro av olika [α-32P] NTP i standard-NMPyleringsanalysen.(A, överst) Coomassie-färgad nsp9-His6 separerad av SDS-PAGE.(A, botten) Autoradiogram av samma område av gelén.(B) Den relativa aktiviteten (medelvärde ± SEM) i närvaro av den angivna nukleotidkofaktorn bestäms från tre oberoende experiment.*P≤0,05.(C) Metalljonernas roll.Visat är standard-NMPyleringstestet i närvaro av [α-32P] UTP och olika metalljoner, var och en med en koncentration av 1 mM.I C visas den översta, Coomassie-färgade nsp9-His6, och i C, den nedre, visas motsvarande autoradiografi.Storleken på det märkta proteinet (i kilodalton) visas till vänster om A och C. (D) Den muterade formen av HCoV-229E nsp12-His6 som bär den specificerade aminosyrasubstitutionen är i [α-32P]UTP, enligt beskrivningen i Material och metoder.Den radiomärkta nsp9-His6 som produceras i NMPyleringsreaktionen detekteras genom fosforyleringsavbildning (D, överst).Den relativa aktiviteten jämfört med vildtypsproteinet (wt) visas i D, och botten tas som medelvärdet (±SEM) från tre oberoende experiment.Asterisker indikerar substitutioner av icke-konserverade rester.(E) Virustitern i odlingssupernatanten av pl-celler erhållen 24 timmar efter infektion bestämdes genom plackanalys.Kodonsubstitutionerna i NiRAN-domänen av den konstruerade HCoV-229E-mutanten är indikerade (restnumrering baseras på deras position i pp1ab).Den replikationsbristiga RdRp aktiva ställe-mutanten nsp12_DD4823/4AA användes som kontroll.
För att få en djupare förståelse av det aktiva stället för NiRAN och bestämma resterna relaterade till aktiviteten av nsp9-specifikt NMP-transferas, utförde vi mutationsanalys, där vi ersatte de konservativa resterna i NiRAN AN-, BN- och CN-motiven ( 16) Det är Ala (SI bilaga, figur S2).Dessutom utvärderades effekten av konservativa Arg-till-Lys- eller Lys-till-Arg-substitutioner i två fall.Som en (negativ) kontroll ersätts rester som inte eller mindre konserverade i NiRAN-domänen av coronavirus och andra kapslade virus med Ala. Ersätter K4116A (i motiv preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motiv BN) och D4280A (CN) minskar eller till och med eliminerar nsp9 NMPylering genom nsp12, medan proteiner med konservativa substitutioner (R4178K), K4116R) behåller 60% och 80% av sin aktivitet, vilket indikerar att uppmjukningen av restriktionerna på deras respektive sida kedjor är fysikalisk-kemiskt känsliga (Figur 3D).Att ersätta flera andra konserverade rester E4145A, D4273A, F4281A och D4283A är mycket mindre skadligt, och nsp9 UMPylering reduceras endast måttligt.Liknande resultat erhölls i nsp9 NMPyleringsreaktioner som involverade andra NTP: er (Figur 3D och SI bilaga, Figur S3), vilket bekräftar att de observerade effekterna på specifika aminosyrasubstitutioner är oberoende av typen av nukleotidsamsubstrat som används.Därefter testade vi den möjliga effekten av dessa nsp12-substitutioner på replikeringen av koronavirus i cellkultur.För detta ändamål använde vi lämpliga genetiskt modifierade komplementära DNA (cDNA)-mallar klonade i rekombinant vacciniavirus (23, 24) för att transkribera 5-7 celler.Titrering av infektiös virusavkomma producerad i dessa celler visade att de flesta HCoV-229E NiRAN-mutanter inte var genomförbara (Figur 3E).En grupp icke-viabla virala mutanter inkluderar alternativ som har visat sig eliminera eller signifikant minska NMP-transferasaktivitet in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), men det finns två andra alternativ (K4116R, E4145A) % reserverat?Deras NMPyleringsaktivitet in vitro tyder på att ytterligare restriktioner är involverade.På liknande sätt producerade två andra mutationer (R4178K, F4281A) som orsakade en måttlig minskning av NiRANs NMPyleringsaktivitet in vitro levande virus, men dessa virus reducerade signifikant titrar genom replikering.I överensstämmelse med aktivitetsdata in vitro som visas i figur 3D, ersätter fyra andra rester som inte är konserverade i coronavirus och/eller andra kapslade virus (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) producerade livsdugliga virus. Avkomman, trots att de hade en måttligt reducerad titer jämfört med vildtypsviruset (Figur 3E).
För att studera om NiRAN-medierad NMP-transferasaktivitet beror på den aktiva RdRp-domänen, ersattes de två konserverade Asp-rester som är involverade i koordinationen av tvåvärda metalljoner (11) i RdRp-motiv C med Ala. Det resulterande proteinet nsp12_DD4823/4AA behåller dess nsp9 NMPyleringsaktivitet, vilket indikerar att nsp12-medierad in vitro nsp9 NMPyleringsaktivitet inte kräver polymerasaktivitet (SI bilaga, figur S4).
Efter att ha etablerat den nsp9-specifika NMP-transferasaktiviteten för nsp12 försökte vi karakterisera NMP-nsp9-addukten genom masspektrometri (MS).Det fullständiga proteinmasspektrumet för rekombinant HCoV-229E nsp9 visade en topp vid 12 045 Da (Figur 4A).Tillsatsen av nsp12 förändrade inte kvaliteten på nsp9, vilket indikerar att nsp12 och nsp9 inte skulle bilda ett stabilt komplex under de använda betingelserna (denaturering) (Figur 4A).I närvaro av UTP och GTP visade massmätningen av reaktionen innehållande nsp9 respektive nsp12 att proteinmassan av UTP flyttade 306 Da och proteinmassan av GTP flyttade 345 Da, vilket indikerar att varje nsp9-molekyl binder en UMP eller GMP (Bild 4) C och D).Det spekuleras att den energi som krävs för NiRAN-medierad nsp9 NMPylering kommer från NTP-hydrolys och pyrofosfatfrisättning.Även om ett 10-faldigt molärt överskott av nsp9 (mål) än nsp12 (enzym) användes i denna reaktion, observerades nästan fullständig NMPylering av nsp9, vilket tyder på att interaktionen mellan nsp12 och nsp9 är kortlivad, och nsp12 kan NMPylera mer nsp9 in vitro-molekyl.
Enkel NMPylering av nsp9 i närvaro av nsp12 och UTP eller GTP.Visat är det dekonvoluterade kompletta proteinmasspektrumet för HCoV-229E nsp9 (SI bilaga, tabell S1) (AD).(A) enbart nsp9, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 i närvaro av UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 i närvaro av GTP.
För att bestämma nsp9-resterna UMPylerade med nsp12, klövs nsp9-UMP med trypsin.De resulterande peptiderna separerades med nano-högpresterande vätskekromatografi (HPLC) och analyserades med tandemmasspektrometri (MS/MS) online.Dataanalys med användning av Byonic mjukvarupaket (Protein Metrics) visade UMPylering av den N-terminala aminosyran.Detta bekräftas manuellt.Tandemmasspektrumet för prekursorpeptiden [UMP]NNEIMPGK (SI-appendix, figur S5A) avslöjade ett fragment vid 421 m/z, vilket indikerar att UMP binder till rest 1 av nsp9.
Vid N-terminalen av nsp9 är Asn bevarad bland medlemmarna av Orthocoronavirinae (SI bilaga, figur S6).Även om vi tror att det N-terminala primära aminkvävet är den mest sannolika acceptorn för UMP, bestämde vi oss för att skaffa ytterligare bevis på NMP-bindning vid N-terminalen.Av denna anledning härleddes den icke-NMPylerade och NMPylerade N-terminala peptiden nsp9 renad med HPLC i närvaro av aceton och natriumcyanoborhydrid.Under dessa förhållanden kan endast fria primära aminer modifieras med propyl (25).Den N-terminala nsp9-härledda peptiden med sekvensen NNEIMPGK innehåller två primära aminer, en vid N-terminalen av Asn och den andra vid sidokedjan av Lys vid C-terminalen.Därför kan propylgrupper införas i båda ändarna.De extraherade jonkromatogrammen för icke-NMPylerade peptider visas i SI-bilagan, figur S5B.Som förväntat kan N-terminala och C-terminala (mono)propylerade (SI bilaga, figur S5B, övre bana) och dipropylerade peptider (SI bilaga, figur S5B, nedre bana) identifieras.Detta mönster ändras med användningen av den NMPylerade N-terminala peptiden av nsp9.I det här fallet kan endast C-terminala propylerade peptider identifieras, men N-terminala propylerade peptider och dipropylerade peptider identifieras inte (SI Appendix, Figur S5C), vilket indikerar att UMP har överförts till den N-terminala primära aminen. För att förhindra detta grupp från att göra ändringar.
Därefter ersätter vi (med Ala eller Ser) eller tar bort de konserverade resterna vid N-terminalen av nsp9 för att definiera målspecifika begränsningar.Baserat på våra MS-data som visar att NiRAN bildar en nsp9-NMP-addukt med den primära aminen av den N-terminala resten av nsp9, antog vi att nsp9 NMPylering kräver att det virala masterproteaset (Mpro, nsp5) frisätter nsp9 N-terminalen från dess polyproteinprekursor.För att testa denna hypotes producerade vi ett prekursorprotein nsp7-11 innehållande nsp9 i E. coli och utförde ett standard NMPyleringstest i närvaro av [α-32P] UTP (material och metoder).Som visas i figur 5A (bana 3) är den oklippta nsp7-11-prekursorn inte radiomärkt med nsp12.Däremot, om nsp7-11 klyvs av rekombinant nsp5 för att frigöra nsp9 (och andra nsps) från prekursorn, detekteras ett radiomärkt protein som migrerar med nsp9, vilket bekräftar vår slutsats att NiRAN och N-selektiv bildning av kovalenta nsp9-NMP-addukter .Den terminala primära aminen av den N-terminala Asn (position 3825 i pp1a/pp1ab).Denna slutsats stöds också av experiment med användning av nsp9-konstruktionen, som innehåller en eller två ytterligare rester vid N-terminalen.I båda fallen avskaffades NiRAN-medierad UMPylering av nsp9 (SI bilaga, figur S7).Därefter producerade vi ett protein med en eller två Asn-rester borttagna från 3825-NNEIMPK-3832-peptidsekvensen vid N-terminalen av nsp9.I båda fallen blockerades nsp9 UMPylering fullständigt (Figur 5B), vilket ger ytterligare bevis för att den verkliga nsp9 N-terminalen fungerar som en NMP-receptor.
Den proteolytiska bearbetningen av nsp9 och rollen för N-terminala rester i nsp12-medierad UMPylering.(A) nsp9 UMPylering kräver en fri nsp9 N-terminal.Nsp7-11-His6 förinkuberas vid 30 °C i NMPyleringsdetektionsbuffert innehållande UTP i närvaro eller frånvaro av rekombinant Mpro (nsp5-His6).Efter 3 timmar, starta NMPyleringsanalysen genom att tillsätta nsp12-His6 enligt beskrivningen i Material och metoder.Reaktionen innehållande nsp5-His6 (bana 1) och nsp9-His6 (bana 2) användes som en kontroll.Efter 10 minuter avslutades reaktionen och reaktionsblandningen separerades med SDS-PAGE.Proteinet färgades med Coomassie Brilliant Blue (A, överst).Nsp7-11-His6-prekursorn och den bearbetade produkten som härrör från nsp5-His6-medierad klyvning visas till höger.Observera (på grund av deras ringa storlek) att nsp7 och nsp11-His6 inte kan detekteras i denna gel, och reaktionen kompletteras med nsp5-His6 (banorna 1 och 4; positionen för nsp5-His6 indikeras med en hel cirkel) eller nsp9-His6 (bana 2) innehåller en liten mängd MBP (indikerad med öppna cirklar) som kvarvarande föroreningar eftersom de uttrycks som MBP-fusionsproteiner (SI bilaga, tabell S1).(B) Nsp9-His6-varianten saknar en eller två N-terminala Asn-rester (restnumrering enligt positionen i pp1a/pp1ab) och renas och inkuberas med nsp12-His6 och [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE färgad med Coomassie visas överst, B, motsvarande autoradiograf visas längst ner.Positionen för molekylviktsmarkören (i kilodalton) visas till vänster.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-terminala konserverade rester ersattes med Ala eller Ser, och samma mängd protein användes i den nsp12-His6-medierade UMPyleringsreaktionen.Reaktionsprodukterna separerades med SDS-PAGE och färgades med Coomassie Brilliant Blue (C, överst), och radiomärkt nsp9-His6 detekterades genom fosforescensavbildning (C, mitten).Med användning av vildtypsprotein (wt) som referens (inställt på 100%), beräknades den relativa NMPyleringsaktiviteten (medelvärde ± SEM) från tre oberoende experiment.(D) Virustitrar i pl-cellkultursupernatanten av Huh-7-celler infekterade med HCoV-229E vildtyp Huh-7-celler, och mutanter som bär angivna aminosyrasubstitutioner i nsp9 bestämdes genom plackanalys.Den replikationsbristiga RdRp-motivet C dubbelmutanten DD4823/4AA användes som en negativ kontroll.
N-terminalen av nsp9 (särskilt positionerna 1, 2, 3 och 6) är mycket bevarad bland medlemmar av underfamiljen Orthocoronavirinae (SI bilaga, figur S6).För att studera den möjliga rollen för dessa rester i nsp12-medierad nsp9 NMPylering, ersattes två på varandra följande Asn-rester vid N-terminalen av nsp9 med Ala eller Ser (ensamma eller i kombination).Jämfört med vildtyp nsp9, resulterade ersättning av N3825 med Ala eller Ser i mer än en tvåfaldig minskning av nsp12-medierad UMPylering (Figur 5C).I överensstämmelse med vår slutsats att NMPylering sker vid den N-terminala primära aminen istället för sidokedjan av den N-terminala resten, observerade vi signifikant kvarvarande NMPylering med ersättning av N3825A och N3825S.Intressant nog, om den andra Asn ersätts med Ala eller Ser, reduceras nsp9 UMPylering kraftigare (mer än 10 gånger), medan ersättningen av Ala vid positionerna 3, 4 och 6 endast har en måttlig effekt på nsp9 UMPylering (Figur 2) ) .5C).Liknande resultat erhölls med ATP, CTP eller GTP (SI bilaga, figur S8).Sammantaget indikerar dessa data nyckelrollen för N2826 (position 2 i nsp9) i nsp9 NMPylering.
För att erhålla ytterligare bevis på den funktionella korrelationen mellan N-terminalen av nsp9 och NMPylering, utförde vi en multipelsekvensanpassning (MSA) av nsp9-sekvensen av Coronavirus-familjen (varierande mellan 104 och 113 rester) (SI Appendix, figur S6).Totalt, i 47 (kända och förmodade) arter av 5 släkten av underfamiljen Orthocoronavirinae som infekterar olika däggdjur, fåglar och reptilvärdar, visade sig endast 8 rester totalt vara invarianta.De mest omfattande förändringarna, inklusive deletioner och insättningar, observerades i cyklerna mellan de sekundära strukturelementen i nsp9, vilket bestämts av tidigare strukturella studier (26 ??28).Fem invarianta rester hittades i β-strängen och α-helixen i den C-terminala delen av nsp9.Tre invarianta rester utgör NNE-motivet för N-terminalen av nsp9.Det avslöjas att den andra Asn av detta motiv är den enda invarianta resten, som också delas av den hypotetiska nsp9 av det avlägset besläktade grodcoronaviruset, och representerar Microhyla letovirus 1-arten i underfamiljen Letovirinae av Alphaletovirus.Bevarandet av rester i nsp9 sekundära strukturelement kan rationaliseras av strukturella överväganden för att bibehålla veckning eller kända RNA-bindande egenskaper.Detta resonemang tycks dock inte gälla bevarandet av NNE, och före denna studie var karaktären av de begränsningar som begränsar variationen av tripeptidsekvensen helt otydliga.
För att bestämma vikten av nsp9-NMPylering och NNE-konservering i koronavirusreplikation, producerade vi HCoV-229E-mutanter, som bär enkla eller dubbla substitutioner av nsp9 N-terminala rester, vilket indikerar att nsp9 NMPylering är skadligt in vitro.Innan vi börjar försöker vi svara på frågan om dessa substitutioner (nära nsp8|9-klyvningsstället) påverkar den proteolytiska bearbetningen av den C-terminala pp1a-regionen.En uppsättning nsp7-11-polyproteinkonstruktioner innehållande motsvarande substitutioner vid N-terminalen av nsp9 producerades i E. coli och skars med rekombinant Mpro.Den proteolytiska klyvningen av de fyra platserna (inklusive det nsp9-flankerande stället) påverkas inte signifikant av några införda substitutioner (SI-bilaga, figur S9), exklusive strukturella förändringar i dessa proteiner som interfererar med Mpro-medierad nsp8|9-klyvning (eller annat) hemsida.
Huh-7-celler transfekterades med genomlängd HCoV-229E RNA, som kodar för Ala- eller Ser-substitutioner i de konserverade NNE-tripeptiderna (N3825, N3826 och E3827) vid nsp9 N-terminalen, vilket visar att de flesta av mutationerna är dödliga.Vi kunde rädda viruset genom att ersätta Ser eller Ala av den N-terminala Asn (N2835A eller N2835S), men misslyckades med att återställa viruset med andra enkla och dubbla mutationer i NNE-sekvensen (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (Figur 5D).
Dessa resultat indikerar att replikeringen av koronavirus i vävnadskultur är begränsad (samma eller liknande), vilket begränsar den naturliga mutationen av nsp9 NMPyleringsställen i kroppen och stödjer nyckelrollen för detta svar i livscykeln för koronavirus.
I den sista uppsättningen experiment producerade vi C-terminal His6-märkt SARS-CoV-2 nsp12 och nsp9, och två muterade former av nsp12 i E. coli.De aktiva platserna i NiRAN- och RdRp-domänerna var respektive Använd Ala istället (Figur 6A och SI-bilaga, Tabell S2).K4465 i SARS-CoV-2 nsp12 motsvarar K4135 i HCoV-229E (SI Appendix, Figur S2), vilket visade sig vara nödvändigt för NiRAN-aktivitet och HCoV-229E-replikering (Figur 3D och E).Denna rest motsvarar också den arteriella virus-EAV nsp9 K94-resten, som tidigare visat sig vara nödvändig för NiRAN-själv-UMPylering/själv-GMPylering (16).Som visas i figur 6B har SARS-CoV-2 nsp12 UMP-transferasaktivitet med användning av nsp9 som ett substrat, medan nsp12_K4465A aktiva platsmutanten är inaktiv.Den dubbla substitutionen i den karakteristiska SDD-sekvensen av RdRp-motiv C påverkar inte UMP-transferasaktivitet (Figur 6B), vilket indikerar att RdRp-aktivitet inte har någon direkt effekt vid nsp9 UMPylering.Liknande data erhölls med CTP, GTP och ATP (SI bilaga, figur S10).Sammanfattningsvis indikerar dessa data att NiRAN-medierad nsp9 NMPylering har en konservativ aktivitet i coronavirus som representerar olika släkten av ortocoronavirus-underfamiljen.
SARS-CoV-2 nsp12-medierad NMPylering av nsp9.(A) Coomassie-färgad SDS-polyakrylamidgel som visar det rekombinanta proteinet som användes i NMPyleringstestet.Som kontroll användes ett mutantprotein med substitution av aktivt ställe i NiRAN-domänen (K4465A) och RdRp-domänen (DD5152/3AA) av SARS-CoV-2 nsp12.Restnumrering baseras på position i pp1ab.(B) Autoradiograf av UMPyleringsdetektion med användning av nsp9-His6 och [α-32P]UTP som substrat för nsp12-His6 (vildtyp [wt] och mutant).Molekylmassan (i kilodalton) för det märkta proteinet visas till vänster.
NiRAN-domäner är i allmänhet konserverade i Nidovirales (16), vilket indikerar att de katalyserar enzymatiska reaktioner som är nödvändiga för replikering av nidovirus.I denna studie kunde vi bevisa att NiRAN-domänen för coronaviruset överför NMP (genererad från NTP) till nsp9, ett mystiskt RNA-bindande protein involverat i virusreplikation (26 ?? 29 ), för att bestämma det som ett naturligt mål och partner till coronavirus RTC.
NiRAN-domänen delar tre sekvensmotiv (AN, BN och CN), som innehåller ett mycket litet antal rester som är konserverade i alla familjer i den monofyletiska men mycket differentierade Nidovirales-ordningen (8, 16).Nyligen genomförda studier har visat att de är strukturellt relaterade till en i stort sett okarakteriserad familj av proteinkinasliknande proteiner, som ursprungligen kallades SelO-familjen (17, 19, 22, 30, 31).SelO-relaterade proteiner har kinasveck, men saknar flera konserverade rester av det aktiva stället i klassiska kinaser (22, 32).Baserat på den omvända orienteringen av ATP-molekyler bundna till det aktiva stället och stabiliserade genom specifika interaktioner, antogs SelO och bekräftades därefter överföra AMP (istället för fosfat) till proteinsubstratet (22), medan ett annat bakteriellt SelO-liknande protein YdiU har nyligen visat sig katalysera den kovalenta bindningen av UMP till Tyr och His-rester av olika proteinsubstrat (33).
För att bekräfta och utöka förutsägelsen av de förmodade resterna av det aktiva stället i coronavirus NiRAN-domänen använde vi biokemiska och omvänd genetikmetoder för att utföra mutationsanalys på coronaviruset nsp12 (Figur 3D och E och SI bilaga, Figur S3 och tabell) S1â S4).Data visar att ersättningen av HCoV-229E K4135, R4178 och D4280 med Ala eliminerar in vitro NMP-transferasaktivitet och virusreplikation i cellkultur (Figur 3D och E och SI bilagor, Figur S3), vilket stöder deras närvaro i NTP γ-fosfat ( K4135, R4178) och koordinationen av metalljoner på det aktiva stället (D4280).E4145A-substitutionen av det konserverade Glu i området för fågelboet som förutspåddes stabilisera positionen K4135 (17) visades eliminera viral replikation, men överraskande nog bibehölls aktiviteten i NMPyleringsanalysen in vitro (Figur 3D och E och SI-bilaga, figur S3 och tabellerna S1–S4).En liknande observation gjordes när motsvarande substitution introducerades i YdiU-homologen av Salmonella typhimurium (E130A) (33).Sammantaget stödjer dessa data den reglerande funktionen hos denna konserverade rest snarare än den katalytiska funktionen.
Att ersätta den konserverade Phe-resten (F4281A) inom området för nestovirus i HCoV-229E NiRAN-domänen (8) resulterade i en minskning av NMPyleringsaktivitet in vitro och en signifikant minskning av virusreplikation i cellkultur (Figur 3D, E och SI) bilaga, figur S3).Data överensstämmer med den viktiga regulatoriska funktionen hos denna rest, såsom den homologa DFG-motivet Phe-rest som visats tidigare.I klassiska proteinkinaser är det en del av Mg2+ bindningsslingan och hjälper till att montera och reglera ryggraden???Krävs för effektiv katalytisk aktivitet (32, 34).Att ersätta Ala och Arg med K4116-rester (i preAN-motivet) respektive eliminerade viral replikation och hade, som förväntat, olika effekter på NMP-transferasaktivitet in vitro, beroende på den introducerade aminosyrasidokedjan (Figur 3D och E och SI bilagor , figur S3).Funktionsdata överensstämmer med den strukturella informationen, vilket indikerar att denna rest har etablerat en interaktion med ATP-fosfat (17).I NiRAN-domänen för andra kapslade virusfamiljer är positionen för HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 ockuperad av Lys, Arg eller His (8), vilket indikerar att den funktionella begränsningen av denna specifika rest har mildrats.Substitutionen av D4188A och D4283A eliminerar eller kraftigt reducerar enzymaktivitet och eliminerar virusreplikation (Figur 3).Dessa två rester är konserverade i de flesta (men inte alla) kapslade virus (8), vilket indikerar en viktig familjespecifik men möjligen icke-katalytisk funktion.Ala-substitutioner av flera andra Lys- och Asp-rester (K4113A, D4180A, D4197A och D4273A) som inte är konserverade i Coronaviridae eller andra Nestioviridae-familjer (8) användes som kontroller.Som förväntat är dessa substitutioner i stort sett tolererbara, med en liten minskning av enzymaktivitet och viral replikation i vissa fall (Figur 3 och SI-bilaga, Figur S3).Sammantaget är koronavirusmutagenesdata mycket överensstämmande med själv-GMP och omvänd genetikdata för EAV NiRAN-RdRp (16), där EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortolog) rest K94 (motsvarande HCoV-229E K4135) är viktiga funktioner), R124 (motsvarande R4178), D132 (motsvarande D4188), D165 (motsvarande D4280), F166 (motsvarande F4281).Dessutom överensstämmer HCoV-229E-mutagenesdata med och utökas från tidigare rapporterade SARS-CoV omvänd genetikdata (16), lika mycket lika de som observerats för motsvarande CN-motiv Phe-to-Ala mutant SARS-CoV_nsp12. fenotyp beskriven -F219A och HCoV-229E_F4281A (Figur 3 D och E och SI bilaga, Figur S3 och Tabell S1-S4).
Jämfört med EAV-ortologer (16), som har en tydlig preferens för UTP och GTP (i själv-NMPyleringsreaktionen), visar vår studie att coronavirusets NiRAN-domän (representerad av HCoV-229E och SARS-CoV-2) kan vara effektivt överfört Alla fyra NMP, även om det finns en liten preferens för UMP (figur 1 och 3).Den relativt låga specificiteten för det specifika NTP-samsubstratet överensstämmer med den nyligen rapporterade SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 superkompositstrukturen, i vilken ADP-Mg2+ binder till det aktiva stället för NiRAN, men inte med adenindelen. av bildandet av specifika interaktioner (17).I vår studie har typen av nukleotid som används i NMPyleringsreaktionen ingen differentiell effekt på aktiviteten hos mutantproteinet (SI Bilaga, figur S3), vilket indikerar att ingen av dessa rester är nära relaterade till bindningen av en specifik nukleobas.Den strukturella grunden och potentiella biologiska betydelsen av de olika NTP-samsubstratpreferenserna som observerats i NiRAN-domänerna av coronavirus och arteriella virus återstår att studera;de kan vara sanna eller kan bero på begränsningarna i deras respektive studier.För närvarande kan det inte uteslutas att den potentiella NMPylatoraktiviteten hos artärvirusets NiRAN-domän (jämfört med den tidigare karakteriserade själv-NMPyleringsaktiviteten) har en annan samsubstratpreferens, med hänsyn till att likheten mellan artärviruset och coronaviruset NiRAN-domänen är på sin gräns.Sekvensbaserad Jämför (16).Jämfört med pseudokinaset SelO, som använder Mg2+ som en kofaktor, är aktiviteten av coronavirus och arteriellt virus NiRAN beroende av Mn2+ (16) (Figur 3C och SI bilaga, Figur S1).Mn2+-beroendet och den uppenbara preferensen för UTP är en ovanlig egenskap hos protein-NMPylatorer, och har bara nyligen bekräftats i YdiU-proteinet från Salmonella typhimurium, som katalyserar den strikta Mn2+-beroende proteinchaperonen UMPylering för att skydda celler från stressinduktion Cell ATP-pool ( 33).
Den nyligen beskrivna strukturella likheten mellan coronavirusets NiRAN-domän och cellulära proteinkinaser (17, 19) ger ytterligare stöd för NiRANs förmåga att kovalent koppla NMP till andra proteiner som vi har rapporterat i denna studie.Vi fokuserade vårt sökande efter möjliga NiRAN-mål på de proteiner som kodas av HCoV-229E ORF1a, som är kända för att direkt eller indirekt hjälpa RTC:s ORF1b-kodade replikas (12, 35).Våra experiment ger avgörande bevis för effektiv och specifik NMPylering av nsp9 (Figur 2).Om målproteinet används i ett molärt överskott som är 8 till 10 gånger högre än för enzymet (nsp12), bekräftas det att nsp9 är fullständigt (mono)NMPiserat (Figur 4).Vi drog slutsatsen att interaktionen mellan nsp12 och nsp9 är kortlivad och inte kommer att bilda ett stabilt komplex med nsp9 (i frånvaro av andra RTC-subenheter).Denna slutsats stöds av proteininteraktionsstudier på SARS-CoV-proteomet (35).MS-analys identifierade den primära aminen av den N-terminala resten av nsp9 som NMPyleringsstället (SI bilaga, figur S5).Bildandet av fosforamidatbindningen och den N-terminala aminogruppen skiljer den NiRAN-medierade NMPyleringsaktiviteten från den Pseudomonas syringae SelO-medierade AMPyleringsreaktionen, som katalyserar bildningen av O-kopplad AMP vid Ser-, Thr- eller Tyr-rester Peptidaddukt ( 22), och S. typhimurium YdiU bildar O-kopplade (med Tyr) och N-kopplade (med His) peptid-UMP-addukter.Den begränsade informationen som finns tillgänglig om SelO-familjen av proteiner indikerar att medlemmar av denna stora proteinfamilj skiljer sig mycket åt i bildningen av peptid-NMP-addukter.Detta är en intressant observation som förtjänar ytterligare studier.
Data som erhölls i denna studie ledde till att vi antog att NMPyleringen av nsp9 kräver en fri N-terminal.I samband med viral replikation kommer detta att tillhandahållas av den proteolytiska klyvningen av nsp8|nsp9-bearbetningsstället i replikaspolyproteinet pp1a medierat av Mpro och pp1ab.I de flesta coronavirus är skillnaden mellan denna specifika plats (VKLQ|NNEI i HCoV-229E) och alla andra koronavirus-Mpro-klyvningsställen att Asn (istället för en annan liten rest, såsom Ala, Ser Eller Gly) upptar P1â???Plats (36).Peptidklyvningsdata som erhölls i de tidiga studierna visade att klyvningseffektiviteten för nsp8|nsp9-stället var lägre än för andra ställen, vilket indikerar att 1) detta specifika ställe kan ha en reglerande roll i den snabba koordinerade bearbetningen av C-terminalen pp1a-regionen, eller 2) a Rollen för den speciella konserverade nsp9 N-terminalen i virusreplikation (37).Våra data (Figur 5A) visade att den rekombinanta formen av nsp9 som bär den verkliga N-terminala sekvensen effektivt NMPiserades av nsp12.Den N-terminala flankerande sekvensen avlägsnades med faktor Xa (nsp9-His6; SI bilaga, tabell S1) eller Mpro-medierad klyvning (nsp7-11-His6; figur 5A och SI bilaga, tabell S1).Viktigt är att den oklippta nsp9-innehållande prekursorn nsp7-11-His6 visade resistens mot NMPylering av nsp12, vilket överensstämmer med våra data, vilket indikerar att nsp9-NMP-addukten bildas genom den N-terminala primära aminen (SI bilaga, figur S5) .För att få en djupare förståelse av NiRAN-substratspecificitet fokuserade vi sedan på de intilliggande N-terminala resterna av nsp9.I frånvaro av andra proteiner är de strukturellt flexibla, vilket förhindrar att de upptäcks i den omärkta formen av nsp9 (26 28, 38), vilket indikerar deras begränsade naturliga variation. Detta beror på den viktiga sekvensspecifika (ej sekundär strukturrelaterad) funktion av det nsp9 N-terminala fragmentet.Ala-substitutioner av konserverade rester i denna region (figur 5C och D och SI-bilaga, figur S8) avslöjar att N3826 är väsentlig för nsp9 NMPylering in vitro, medan N3825A och E3827A substitutioner leder till en minskning av NMPylering, medan M3829A och P3830A inte gör substitutioner .Uppenbarligen påverkar nsp9 NMPylering.Även om substitutionen av N-terminal Asn (N3825A, N3825S) endast har en måttlig effekt på nsp9 NMPylering och virusreplikation i cellkultur (Figur 5C och D), kan deletionen av en Asn-restsekvens från den N-terminala 3825-NN-dipeptiden visat sig vara det är dödligt för virus, vilket indikerar att en Asn-rest krävs före en annan rest vid N-terminalen, företrädesvis Asn, även om det verkar som att substitution av liknande rester delvis kan tolereras (Figur 5B, C och D).Vi drar slutsatsen att 3825-NN-dipeptiden, särskilt den konserverade och essentiella N3826-resten inom coronavirusområdet (SI-bilaga, figur S6), säkerställer korrekt bindning och orientering av nsp9 N-terminalen i det aktiva stället för NiRAN.
Att ersätta Ala (E3827A) för det konserverade Glu från alla underfamiljer behåller nsp9 NMPylering in vitro men är dödligt för virus i cellkultur (Figur 5C och D), vilket indikerar den ytterligare funktionen hos denna rest, till exempel i nyckelinteraktioner (NMPylerad eller omodifierad) ) nsp9 N-terminal och andra faktorer involverade i virusreplikation.Nsp9-mutationer påverkade inte den proteolytiska processen för nsp9 eller någon intilliggande nsps (39) (SI-bilaga, figur S9), vilket indikerar att de dödliga fenotyperna av flera observerade nsp9-mutationer inte orsakades av dysregleringen av det C-proteolytiska processterminala pp1a-området .
Ovanstående data ger bevis för att efter Mpro-medierad behandling av nsp8|9-klyvningsstället i pp1a/pp1ab, kan N-terminalen av nsp9 UMPyleras (eller delvis modifieras med en annan NMP).Dessutom ledde det utmärkta bevarandet av N-terminalen av nsp9 (inklusive de singulära och invarianta Asn-resterna i coronavirusfamiljen) och de omvända genetikdata som erhölls i denna studie (figur 3E och 5D) oss att dra slutsatsen att den beskrivna nsp9 NMPyleringen är biologiskt relaterad och väsentlig för replikering av coronavirus.De funktionella konsekvenserna av denna modifiering återstår att studera, till exempel vad gäller den tidigare beskrivna (icke-specifika) RNA-bindningsaktiviteten för nsp9 (omodifierad form) (2628).N-terminal NMPylering kan också påverka interaktionen av nsp9 med protein- eller RNA-substrat eller bildandet av olika fyra-nivåsammansättningar.Dessa har observerats i strukturella studier och har bekräftats vara funktionellt relaterade till koronavirusreplikation, men särskilt i frånvaro av I fallet med denna modifiering (26-ââ29, 40).
Även om målspecificiteten för coronavirus NiRAN-domänen fortfarande behöver karakteriseras mer i detalj, visar våra data att proteinmålspecificiteten för coronavirus NiRAN-domänen är mycket snäv.Även om bevarandet av nyckelaktiva ställen rester (8, 16) i NiRAN-domänen av alla nidovirusfamiljer starkt stöder aktiviteten hos den konserverade NMPylatorn av dessa proteiner, återstår identiteten för de substratbindande fickresterna i denna domän. Konservering och bevarande måste karakteriseras , och kan skilja sig åt mellan olika familjer av Nidovirales ändamål.På liknande sätt har de relevanta målen för andra kapslade virus ännu inte fastställts.De kan vara avlägsna ortologer av nsp9 eller andra proteiner, eftersom sekvenserna utanför de fem replikasdomänerna som i allmänhet är konserverade i kapslade virus är mindre konserverade (8), inklusive genomarrayen mellan Mpro och NiRAN, bland dem är nsp9 belägen i coronavirus.
Dessutom kan vi för närvarande inte utesluta möjligheten att NiRAN-domänen har ytterligare (inklusive cellulära) mål.I det här fallet är det värt att nämna att bakteriehomologerna i detta framväxande protein NMPylatorer (NMPylatorer) (30, 31) verkar ha "masterregulatorer"?NMP modulerar en mängd olika cellulära proteiner för att reglera eller eliminera deras nedströmsaktiviteter och spelar därigenom en roll i en mängd olika biologiska processer, såsom cellulär stressrespons och redoxhomeostas (22, 33).
I denna studie (figur 2 och 4 och SI-bilaga, figur S3 och S5) kunde vi bevisa att nsp12 överförde UMP (NMP)-delen till en enda (konserverad) position i nsp9, medan andra proteiner inte modifierades i används Under dessa förhållanden stöds väldefinierad (snarare än lös) substratspecificitet.I överensstämmelse med detta, jämfört med N-terminal nsp9 NMPylering, är nsp12s egen NMPyleringsaktivitet mycket låg, dess detektion kräver längre autoradiografiexponeringstid och en 10-faldig ökning av nsp12-koncentrationen används.Dessutom misslyckades vår MS-analys att ge bevis för NMPylering av nsp12, vilket tyder på att NiRAN-domän själv-NMPylering (i bästa fall) är en sekundär aktivitet.Det bör dock noteras att andra studier har gett preliminära bevis för att själv-AMPyleringsstatusen för bakteriell NMPylator kan kontrollera deras NMPyleringsaktivitet på andra proteinsubstrat (22, 33).Därför behövs mer forskning för att undersöka de möjliga funktionella effekterna av själv-NMPyleringsaktiviteter som rapporterats för EAV nsp9 (16) och coronavirus nsp12 (denna studie), inklusive den föreslagna chaperonliknande effekten på veckningen av den C-terminala RdRp-domänen ( 16) ).
Tidigare har flera hypoteser angående de möjliga nedströmsfunktionerna hos den nidovirala NiRAN-domänen övervägts, inklusive RNA-ligas, RNA-kapslat guanylattransferas och proteinprimande aktivitet (16), men ingen av dem är kompatibla med de tillgängliga nedströmsfunktionerna.Informationen som erhålls i följande positioner är exakt samma tid utan att göra ytterligare antaganden.Data som erhållits i denna studie överensstämmer mest med (men kan inte bevisa) att NiRAN-domänen är involverad i initieringen av proteininducerad RNA-syntes.Man trodde tidigare att NiRAN-domänens funktion i 5??²-RNA-kapsling eller RNA-ligeringsreaktioner påverkas inte av dessa och stöd av andra data.Därför anses till exempel det aktiva stället för NiRAN involvera den konserverade Asp som en allmän bas (D252 i Pseudomonas syringae SelO; D4271 i HCoV-229E pp1ab; D208 i SARS-CoV-2 nsp12) (SI Appendix, figur 2) ).S2) (17, 22, 33), medan katalysen i det ATP-beroende RNA-ligaset och RNA-kapslingsenzymet utförs av det kovalenta enzymet-(lysyl-N)-NMP-mellanprodukten, som involverar en icke-förändrad Lys-rest ( 41).Dessutom motsätter den anmärkningsvärda sekvensbaserade specificiteten hos coronavirus NiRAN för konserverade proteinmål och den avslappnade specificiteten för NTP-samsubstrat (föredrar UTP) NiRAN-medierat kapningsenzym eller RNA-ligasliknande funktioner.
Uppenbarligen krävs mycket extra arbete för att verifiera och, om bevisat, utveckla den möjliga rollen av nsp9-UMP (nsp9-NMP) i proteininducerad RNA-syntes, vilket kommer att koppla ihop flera intressanta men (hittills) rapporter som tidigare rapporterats .Enstaka observationer.Till exempel har det fastställts att slutet av den negativa strängens RNA av coronavirus börjar med en oligo(U)-sträng (42, 43).Denna observation överensstämmer med idén att syntesen av negativ-strängad RNA initieras genom att binda den UMPylerade formen av nsp9 till poly(A)-svansen (triggers), som kan främjas av dess RNA-bindning. Aktiviteten och/eller interaktionen med ett annat RTC-protein.UMP-delen som tillhandahålls av nsp9 kan sedan användas som en "primer" för nsp7/8/nsp12-medierad oligouridylering, med användning av 3??²-poly(A)-svansen i det genomiska RNA:t eller en annan oligo-(A)-innehållande sekvens fungerar som en mall, liknande den mekanism som etablerats för picornavirus VPg-proteinet (44).Vad händer om förslaget är "icke-normativt"????Initieringen av den (proteininducerade) negativsträngade RNA-syntesen ger en koppling till observationerna, vilket indikerar att RNA:t med den negativa strängen av coronaviruset har UMP (istället för UTP) i slutet (42), vilket anses indikera att nukleinsyra Dicer klyver änden som är fosforylerad av ett okänt uridinspecifikt endonukleas.Om den bekräftas kan denna nukleinsyrahydrolytiska aktivitet hjälpa till att frigöra den oligomera UMPylerade formen av nsp9 från 5 ² änden av den begynnande negativa strängen.Den möjliga rollen för nsp9 i proteinpriming överensstämmer också med tidigare studier om omvänd genetik, som har visat att nsp9 (och nsp8) interagerar kritiskt och specifikt med det konserverade cis-verkande RNA-elementet nära 3-änden av coronavirus-genomet.45).Enligt denna rapport kan dessa tidigare observationer nu omprövas och utökas genom ytterligare forskning.
Sammanfattningsvis bestämde våra data den specifika aktiviteten hos en proprietär kapslad virusenzymtagg kopplad till RdRp vid N-terminalen.I coronavirus används denna nyupptäckta NiRAN-medierade UMPylator/NMPylator-aktivitet för att förlita sig på Mn2+ och intilliggande Asn-rester och orsaka bildandet av (lågenergi) fosforamidatbindningar med den N-terminala primära aminen.Genom Mpro-medierad klyvning vid nsp8|9-klyvningsstället kan nsp9-målet användas för NMPylering, vilket indikerar den funktionella kopplingen mellan proteaset och NiRAN-domänen, som sträcker sig till RdRp.Bevarandet av nyckelrester i nsp12 NiRAN-aktiva stället och nsp9-målet, kombinerat med data erhållna från två koronavirus inklusive SARS-CoV-2, ger starka bevis för att nsp9 NMPylering är ett coronavirus Konservativa egenskaper är också ett nyckelsteg i virusreplikation.Tillgängliga data leder oss till slutsatsen att den specifika rollen för NMPylerad form av nsp9 i proteininducerad RNA-syntes är ett rimligt scenario för coronavirus och andra kapslade virus, och NiRAN kan också rikta in sig på andra oidentifierade proteiner.Reglera viruset.Värdinteraktion.Om det bekräftas kommer involveringen av proteinprimrar i viral RNA-syntes att öka sekvensaffiniteten för Mpro/3CLpro- och RdRp-domänerna mellan den tidigare detekterade coronaviruset och picornavirusliknande supergruppen (9), som nu har förenats i de nyligen etablerade Pisonivirites ( 46) i kategorin.
Våra data visar också att de grundläggande, selektiva och konservativa enzymaktiviteterna som identifierats i denna studie kan användas som mål för antivirala läkemedel.Föreningar som interfererar med bindningen (och efterföljande modifiering) av den konserverade nsp9 N-terminalen i det aktiva stället för NiRAN kan utvecklas till effektiva och mångsidiga antivirala läkemedel, lämpliga för behandling av animaliska och mänskliga coronavirus från olika (under)släktets infektioner , inklusive SARS-CoV-2 och Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus.
Den kodande sekvensen för coronavirusproteinet som producerats i denna studie amplifierades med RT-PCR med användning av RNA isolerat från Huh-7 infekterat med HCoV-229E eller Vero E6 infekterat med SARS-CoV-2, och infogat med standardkloningsprocedurer.pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) eller pASK3-Ub-CHis6 (47) expressionsvektor (SI bilaga, tabellerna S1 och S2).Enstaka kodonsubstitutioner introducerades genom PCR-baserad platsriktad mutagenes (48).För att producera MBP-fusionsproteinet transformerades E. coli TB1-celler med lämplig pMAL-c2-plasmidkonstruktion (SI bilaga, tabell S1).Fusionsproteinet renades genom amylosaffinitetskromatografi och klövs med faktor Xa.Därefter renades det C-terminala His6-märkta proteinet genom Ni-immobiliserad metallaffinitetskromatografi (Ni-IMAC) som tidigare beskrivits (49).För att producera ubiquitinfusionsproteinet använde E. coli TB1-celler den lämpliga pASK3-Ub-CHis6-plasmidkonstruktionen (SI-bilaga, tabellerna S1 och S2) och pCGI-plasmid-DNA som kodar för ubiquitin-specifikt C-terminalt hydrolas 1 (Ubp1).Transformation (47).Det C-terminala His6-märkta coronavirusproteinet renades som tidigare beskrivits (50).
Själv-NMPyleringstestet av HCoV-229E nsp12-His6 utfördes enligt beskrivningen i EAV nsp9 (16).Kort sagt innehåller nsp12-His6 (0,5 µM) 50 mM 4-(2-hydroxietyl)-1-piperazinetansulfonsyra (HEPES)-KOH, pH 8,0, 5 mM ditiotreitol (DTT), 6 mM MnCl2, 25 µM buffert, 25 µM buffert den specificerade NTP och 0,17 µM matchade [α32-P]NTP (3 000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) vid 30 °C under 30 minuter.I alla andra (standard) NMPyleringsanalyser av nsp12-medierad nsp9 NMPylering justeras reaktionsbetingelserna enligt följande: nsp12-His6 (0,05 µM) och nsp9-His6 (4 µM) i närvaro av 50 mM HEPES-KOH (pH 8). ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM indikerade NTP och 0,17 µM matchad [a32-P]NTP.Efter inkubering i 10 minuter vid 30°C blandades reaktionsprovet med SDS-PAGE provbuffert: 62,5 mM tris(hydroximetyl)aminometan HCl (pH 6,8), 100 mM DTT, 2,5 % SDS, 10 % glycerol och 0,005 % bromfenol blå.Proteinet denaturerades genom upphettning vid 90°C under 5 minuter och separerades med 12% SDS-PAGE.Gelén fixeras och färgas med Coomassie Brilliant Blue-lösning (40 % metanol, 10 % ättiksyra, 0,05 % Coomassie Brilliant Blue R-250), avfärgas och exponeras för en fosforescerande bildskärm i 20 timmar (för att detektera nsp12 från NMPylering) eller (maximalt) 2 timmar (för att bedöma nsp9 NMPylering).En Typhoon 9200 imager (GE Healthcare) användes för att skanna skärmen och ImageJ användes för att analysera signalintensiteten.
För MS-analys användes 1 µM nsp12-His6 och 10 µM nsp9 (utan hexahistidintagg) i NMPyleringsanalys (SI bilaga, Tabell S1) och den ökade koncentrationen av 500 µM UTP och GTP användes.Beroende på deras koncentration och förväntade proteinkvalitet användes ett Waters ACQUITY H-klass HPLC-system utrustat med en MassPrep-kolonn (Waters) för att avsalta 1 till 10 µL buffrade proteinlösningar online.Det avsaltade proteinet elueras in i elektrosprayjonkällan för Synapt G2Si masspektrometer (Waters) genom följande gradient av buffert A (vatten/0,05 % myrsyra) och buffert B (acetonitril/0,045 % myrsyra), och kolonntemperaturen är 60°C och en flödeshastighet på 0,1 ml/min: eluering isokratiskt med 5 % A i 2 minuter, sedan en linjär gradient till 95 % B inom 8 minuter, och bibehåll 95 % B i ytterligare 4 minuter.
Positiva joner med ett massintervall på 500 till 5000 m/z detekteras.Glu-fibrinopeptid B mäts var 45:e sekund för automatisk massdriftkorrigering.Använd MassLynx instrumentprogramvara med MaxEnt1-förlängning för att dekonvolvera medelspektrumet efter avdrag för baslinjen och utjämning.
UMPylerad HCoV-229E nsp9 digererades genom tillsats av modifierat trypsin av sekvenseringsgrad (Serva) och inkuberades över natten vid 37 °C.En Chromabond C18WP spin-kolonn (artikelnummer 730522; Macherey-Nagel) användes för att avsalta och koncentrera peptiderna.Slutligen löstes peptiden i 25 µL vatten, som innehöll 5 % acetonitril och 0,1 % myrsyra.
Proverna analyserades av MS med användning av en Orbitrap Velos Pro masspektrometer (Thermo Scientific).Det ultimata nanoâ HPLC-systemet (Dionex), utrustat med en anpassad ändmonterad 50 cm??75 μm C18 RP-kolonn packad med 2,4 μm magnetiska pärlor (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Anslut till masspektrometern online via Proxeon nanospraykällan;injicera 6 µL trypsinuppslutningslösning i en 300 µm innerdiameter ×??1 cm C18 PepMap förkoncentrationskolonn (Thermo Scientific).Med användning av vatten/0,05 % myrsyra som lösningsmedel, fångades provet automatiskt och avsaltades med en flödeshastighet av 6 µL/min.
Följande gradienter av vatten/0,05 % myrsyra (lösningsmedel A) och 80 % acetonitril/0,045 % myrsyra (lösningsmedel B) användes för att uppnå separationen av tryptiska peptider vid en flödeshastighet av 300 nL/min: 4 % B för 5 minuter, sedan 30 A linjär gradient till 45 % B inom några minuter och en linjär ökning till 95 % lösningsmedel B inom 5 minuter.Anslut den kromatografiska kolonnen till en nano-emitter av rostfritt stål (Proxeon) och spraya eluenten direkt till den uppvärmda kapillären på masspektrometern med en potential på 2 300 V. Undersökningsskanningen med en upplösning på 60 000 i Orbitrap-massanalysatorn är associerad med minst tre data-MS/MS-skanningar, dynamiskt uteslutna i 30 sekunder, med linjär jonfälla-kollisionsinducerad dissociation eller högre energi-kollisionsdissociation kombinerat med orbitrap-detektion, är upplösningen 7 500.
Posttid: 2021-03-03